Painel NGS de Deficiência de Recombinação Homóloga e Integridade Genômica (HRD)

O que é?

É um teste genético realizado na amostra de tumor (ovário e outros) para decidir o melhor tratamento possível com ou sem inibidor de PARP. O ensaio HRD é um teste de diagnóstico in vitro baseado em sequenciamento de nova geração (NGS) que avalia:

– Variantes de base única (SNVs);

– Pequenas inserções e deleções (InDels);

– Variações do número de cópias (CNVs) dos genes de recombinação homóloga (16 genes);

– Instabilidade genômica através da avaliação de LOH (loss of heterozygosity), LST (large-scale state transitions) e TAI (telomeric allellic imbalance), usando DNA isolado de tecido tumoral, previamente fixado e incluído em bloco de parafina.

Sinonímias

Painel HRD, HRDOne, Estudo de instabilidade genômica decorrente de mutação em BRCA1 e BRCA2; Mutações em genes da via de Reparo de Recombinação Homóloga do DNA (HRR); Mutações na via HRR para ovário.

Limitações

A quantidade e a qualidade do DNA genômico obtido pode influenciar o desempenho do teste. Tecidos em bloco de parafina apresentam artefatos inerentes ao processamento ao qual são submetidos e que podem prejudicar a obtenção de DNA em quantidade e qualidade adequadas para análise molecular. Tecidos com mais de 3 anos apresentam maior chance de insucesso na realização do exame.

Pequenas inserções e deleções (Indels) maiores do que 25 pb podem não ser detectadas, por motivos que incluem a natureza da mutação, o contexto da sequência, a qualidade do DNA e o conteúdo de DNA não tumoral na amostra.

Duplicações e deleções de genes inteiros podem não ser detectadas. Para variantes de número de cópias (CNVs) intragênicas parciais, o algoritmo de análise pode não distinguir entre a deleção de uma parte do gene e a duplicação da região complementar do mesmo gene. Além disso, a chamada de CNV é altamente dependente do conteúdo tumoral da amostra e da qualidade do DNA, principalmente devido a padrões imprevisíveis de degradação do DNA, inerentes ao processamento ao qual os tecidos são submetidos. Por estes motivos, serão reportadas somente CNVs de alta confiança.

Instruções para envio de amostras:

• Pedido médico com indicação do exame a ser realizado ou formulário de solicitação do teste pela plataforma de gerenciamento dos Programas de Suporte ao Paciente da Indústria Farmacêutica;

– Laudo anatomopatológico e imunohistoquímico;

– Bloco de parafina de carcinomas serosos de alto grau primários do ovário, tuba uterina ou peritônio ou carcinoma endometrioide FIGO G3 primário do ovário.

– As amostras podem ser provenientes do tumor primário ou de alguma metástase.

– Amostras prévias à quimioterapia inicial são preferidas devido à maior chance de sucesso do teste pela maior viabilidade tumoral.

– Bloco de parafina e lâminas com representatividade da neoplasia:

1. Ideal > ou = 50% da superfície tecidual contendo células tumorais;

2. 30% de celularidade tumoral mínima;

– Preferencialmente, solicitamos o envio de todo o material referente ao tecido tumoral a ser estudado, pois assim podemos selecionar o melhor bloco para análise e ainda temos a possibilidade de selecionar outro, caso o resultado seja inconclusivo;

– Se não for possível enviar blocos de parafina, a nossa recomendação é o envio de lâminas sem corar, acompanhadas de lâmina corada por HE (hematoxilina-eosina), do mesmo bloco de parafina;

– Biópsia: mínimo de 8 lâminas sem corar, 10 micra de espessura + 1 HE;

– Peça cirúrgica: mínimo de 5 lâminas sem corar, 10 micra de espessura + 1 HE.

Validação

O teste de mutações em genes na via de reparo de recombinação homóloga tornou-se de extrema importância em laboratórios genômicos clínicos desde o advento da terapia com inibidor de poli(ADP-ribose) polimerase (PARP) para câncer epitelial de ovário, trompa de falópio ou peritônio. No entanto, existem pacientes que podem se beneficiar da terapia com PARPi e não apresentam uma mutação patogênica em BRCA1 ou BRCA2 após análise de sequenciamento e variação do número de cópias.

A DASA Genômica, em parceria com a Sophia Genetics, validou um teste, denominado HRD-One, que detecta não apenas variantes de sequência em genes envolvidos no reparo de recombinação homóloga (HRR), mas também as cicatrizes genômicas decorrentes da Deficiência de Recombinação Homóloga (HRD) que podem estar presentes mesmo quando uma variante patogênica em um dos genes da via de HRR não é detectada. A metodologia combina o sequenciamento direcionado dos genes de HRR e o sequenciamento do genoma de baixa profundidade (low-pass WGS) e possui algoritmos especializados de deep machine learning treinados para reconhecer padrões característicos de instabilidade genômica.

Neste estudo, 59 amostras de câncer de ovário epitelial seroso de alto grau foram testadas e a precisão da pontuação HRD-One foi estabelecida por correlação com a pontuação do HRD comercial disponível (gold standard) e uma validação interna, considerando que a maioria das amostras que carregam uma variante patogênica em BRCA1 ou BRCA2 deve ter HRD.

O HRD-One obteve uma concordância categórica geral de 94,74% com o teste de HRD comercial disponível anteriormente. Para amostras de câncer de ovário epitelial seroso de alto grau, uma pontuação HRD-One de 2,0 ou mais prevê HRD e se correlaciona com a pontuação myChoice^® da Myriad de 42.

Além disso, 12/13 das amostras que carregavam uma variante patogênica ou provavelmente patogênica em BRCA1 / 2 apresentaram uma pontuação de HRD-One positiva. Em relação aos critérios de qualidade, foi observada associação significativa de resultados de baixa confiança com massa de DNA inicial e idade dos blocos de parafina, embora nenhuma associação significativa com a porcentagem estimada de tumor no bloco, o rendimento da biblioteca de NGS e a própria pontuação tenha sido observada. Blocos com mais de 3 anos ou massa de DNA inicial menor do que 25 ng são menos prováveis de produzirem resultados de alta qualidade e alta confiança. Observou-se alta reprodutibilidade para amostras que atingiram o limite mínimo de qualidade, porém é importante notar que as pontuações podem variar em média 1,62 pontos entre as repetições em uma escala de -25,0 a +25,0.

Quarenta e quatro amostras, sendo 32/59 amostras iniciais e mais 12 amostras adicionais de câncer de ovário epitelial seroso de alto grau, também com resultado conhecido do teste myChoice^® da Myriad, foram usadas para validação do teste de HRD do Competidor A. Este ensaio combina a análise de variantes de sequência nos genes BRCA1 / BRCA2 com a determinação do Genomic Scar Score (GSS), uma pontuação algorítmica do status de instabilidade genômica.

O teste de HRD do Competidor A obteve uma concordância categórica geral de 86,4% com o teste da Myriad, menor do que a observada para o HRD-One. Além disso, cerca de 16% das amostras (7/44) processadas com o teste do Competidor A falharam no controle de qualidade, proporção maior do que a taxa de amostras de baixa confiança observada para o HRD-One (7/59; 11,8%).

Comparado ao teste do Competidor A, o HRD-One apresentou maior taxa de concordância, maior correlação linear e polinomial das pontuações, e maior especificidade, quando ambos foram comparados ao teste da Myriad. Apesar da alta sensibilidade do teste do Competidor A, a maior quantidade de resultados potencialmente falso-positivos significaria que parte dos pacientes poderia ser eleita indevidamente para um tratamento que não os beneficiaria. Além disso, o HRD-One avalia uma quantidade maior de genes, o que permite ampliar e aprofundar as análises de outros genes da via de HRR, além de BRCA1 e BRCA2. Portanto, consideramos o HRD-One a alternativa mais confiável para testes de HRD em amostras de tumor ovariano.

Em conclusão, demonstramos que, ao utilizar amostras que atendem aos critérios mínimos de qualidade, uma pontuação HRD-One reprodutível e concordante com o teste comercial gold standard pode ser obtida para inferir a deficiência de recombinação homóloga com alta confiança. Os resultados da validação mostraram que há alta correlação entre a pontuação HRD-One, baseada nos valores de DLD GII, e a pontuação do myChoice® da Myriad, calculada com base em três tipos de cicatrizes genômicas (TAI, LOH e LSTs), o que evidenciou o poder e robustez do HRD-One em discriminar corretamente amostras positivas e negativas em relação ao seu status de HRD.

Como pode ser observado na tabela abaixo, os 3 casos discordantes entre o teste HRD-one e o teste Myriad My Choice estavam dentro da zona cinzenta dos dois testes moleculares.

Quando comparamos os resultados discordantes entre o teste Myriad MyChoice e o teste do Competidor A, as divergências de pontuação do escore para considerar como positivo foram mais acentuadas, o que nos fez tomar a decisão de não implementá-lo na rotina diagnóstica.